Britannian Bulldogs" Kennel

A szuka ivari ciklusa.
Hormonális háttér.

A szukák általában 7-12 hónapos korukban válnak ivaréretté (első tüzelés), míg a tenyészérettséget 18-24 hónaposan érik el, bár bizonyos eltérések tapasztalhatók az egyes fajták között, így a kis és közepes testű fajtáknál általában előbb jelentkezik az első ciklus. Tenyészérettnek mondhatjuk azt az egyedet, mely fajának, fajtájának és korának megfelelő méretű, fejlettségű, és legalább két normális ivarzási cikluson túl van.
A szuka monooestrusos állat, a tüzelések átlagosan 6 havonta (4-12 hónap) követik egymást, és a nemi ciklus négy jelentősebb szakaszra osztható fel: prooestrus ( 9 nap), oestrus ( 9-12 nap), metoestrus ( 2 hó) és anoestrus vagy dioestrus ( 4 hó). Ezekből az ivarzási periódus
(tüzelés: prooestrus + oestrus) 18-21 nap. A kutya szezonálisan ivarzó állat, hiszen tavaszi és őszi ivarzási periódusokat tudunk elkülöníteni, de manapság a nagyfokú beltenyésztettség, a jelentősebb domesztikáció és az optimális táplálkozási viszonyok miatt ezek a periódusok

1. ábra. Hormonális változások a tüzelés alatt szukában. A sárga sáv az optimális fertilitási periódust jelöli.

kissé összemosódtak, és gyakorlatilag az év minden szakában találkozunk tüzelő egyedekkel, bár kétségtelen, hogy észlelhető egy tavaszi és egy őszi "tüzelési hullám". A kutya ivari ciklusának pontos megértéséhez nélkülözhetetlen a ciklus hormonális hátterének ismerete, amely jelentős eltéréseket mutat a gazdasági haszonállatokétól.
A nyugalmi periódus (anoestrus) végén az egyed "biológiai órájának" megfelelően - bár ezt bizonyos környezeti hatások befolyásolhatják, mint pl. domináns szukák tüzelése - fokozódik a hypothalamus GnRH szekréciója, mely a hormon napi ritmikus leadása frekvenciájának és amplitúdójának növekedésében jelentkezik. A fokozódó "pulzáló" GnRH hatás a hypophisis elülső lebenyéből fokozott FSH és LH leadást indukál, és beindítja a petefészekben a tüszők növekedését, valamint azok tüszőhormon (oestrogen) termelését. A fokozódó oestrogen szint egy bizonyos mértékig pozitív "feedback" révén fokozza a saját termelődését serkentő FSH leadást, majd átcsap gátló hatásúvá (negatív "feedback"), blokkolja az FSH leadást és kiváltja az ovulációs LH-csúcsot. A szuka ivarzásának hormonális jellegzetessége az un. preovulációs progeszteron szint, amely azt jelenti, hogy a növekedő tüszők falában kialakuló lutein-szigetek már az ovuláció előtt mérhető és diagnosztikai szempontból jelentős progeszteron (P4) termelést folytatnak. Az LH csúcs (időtartama kb. 24 h) után 36-48 órával bekövetkezik az ovuláció és a kialakuló sárgatestek P4 termelése a 20-25. napra éri el a maximumát, majd csökkenő mértékben kb. 7-8 hétig (a metoestrus végéig) marad fenn. A levált petesejtek azonban azonnal nem fertilisek, mivel egy un. postovulációs érési folyamaton kell átesniük (kb.: 36-48 h). Az érett petesejtek kb. 2-3 napig alkalmas a megtermékenyülésre. Ha nem alakul ki vemhesség abban az esetben is, igen hasonló hormonális folyamatok játszódnak le a metoestrus folyamán a szukában, mint vemhesség idején, kivéve a placentáris Relaxin termelődését (ld. később). A sárgatest progeszteron termelése fennmarad, 25 naptól elkezd emelkedni a prolactin-szint és támogatja a sárgatest működését, valamint elősegíti az álvemhesség kialakulását. Lényeges különbség csak az LH csúcs után kb. 60 nap körül van. Vemhes állatban ilyenkor gyorsan zuhan a P4 szint a felgyorsuló luteolisis hatására (prosztaglandin effektus), míg nem vemhesben igen lassan csökken, kb. a 90. napra éri el az alapértéket ( 0,5-1 ng/ml).

A tüzelés klinikai tünetei

A központi idegrendszerben (hypothalamo-hypophisialis tengely) a hormonális történések már néhány nappal az ivarzás klinikai tüneteinek jelentkezése előtt beindulnak. A tüzelés első szakasza (prooestrus) az első "vércsepp" megjelenésétől az LH csúcsig tart. Ezt a szakaszt a kutya ivarzásának legismertebb tünete a véres ivarzási váladék megjelenése, a péra duzzanat, a hüvelynyálkahártya ödémás duzzanata és a nyálkahártya hámsejtrétegének növekedése uralja, melyeknek a ciklusdiagnosztikánál lesz jelentőségük. Jellegzetes a szuka ivarzási szaga (metil-p-hidroxibenzoát), valamint a fokozódó kanok iránti receptivitása. Az említett tünetek a termelődő tüszőhormonok, az oestrogenek (főleg 17 -oestradiol) hatására alakulnak ki. A prooestrus végén az egyre emelkedő P4 szint és az ovulációval hirtelen lezuhanó oestrogen szint hatására jelentősen csökken a péra és a hüvelynyálkahártya duzzanata, csökken az ivarzási váladék véres jellege, és megváltozik a nyálkahártya felületének sejtösszetétele. Ezen változások már átvezetnek a tüzelés második oestrusnak nevezett szakaszába, mely elején várható az ovuláció (kb. 11-12 nap körül) és a 14-16 nap között beszélhetünk szukánál a legnagyobb fertilitási periódusról. Egyedi eltérés mutatkozik a szukák között, a tűrőképesség időtartamát tekintve; sok esetben a 3-4 napos receptív időszak fennmaradhat hét napig is, esetleg egészen a citológiai metoestrus kezdetéig. Ez azonban nem jelenti a fertilitási periódus elnyúlását is.

A fedeztetés/termékenyítés optimális idejének meghatározása: ovuláció diagnosztika.

A kutya ivarzási periódusa viszonylag hosszú (18-21 nap) és ezen belül a fertilis periódus 2-3 napra tehető, ezért a megfelelő fogamzási eredmények elérése érdekében igen fontos a pontos ciklus diagnosztika. Szuka esetében az ivarzás jelentős élettani "eseményeinek" diagnosztizálása révén a fedeztetés/mesterséges termékenyítés optimális idejének megállapítását, ovuláció diagnosztikának nevezzük.

Ovuláció diagnosztika módszerei:
- viselkedés megfigyelése
- hüvelytükrözés (vaginoscopia)
- hüvelykenet vizsgálata (vaginal cytologia)
- hormonvizsgálatok
- műszeres diagnosztika (ultrahang vizsgálat, hüvelyellenállás mérés)
Az ovuláció diagnosztika esetében önmagában egyik módszer sem ad tévedhetetlen és elégséges információt a szuka ciklusának állapotáról. A leginkább gyakorlatias és alkalmazott módszerek a viselkedés megfigyelésén kívül, melyről leginkább a tulajdonos kikérdezésével kapunk információt, a hüvelytükrözés, a hüvelykenet vizsgálata és a hormonvizsgálatok. Minden esetben sorozatvizsgálatról van szó, melyet általában a ciklus 4-5. napján kezdünk, és kétnaponta ismételjük, amíg nagy biztonsággal a termékenyítés optimális időpontja már prognosztizálható. Alkalmanként mindhárom vizsgálatot el kell végezni és a kapott eredmények szintetizálásával alkossunk diagnózist! A tüzelő szuka viselkedése a tüzelés kezdetével megváltozik: a prooestrusban nyugtalan, könnyen elszökik otthonról, gyakran és több helyre ürít vizeletet (jelölget), erős ivari szaga van, és általában vonzza a kanok jelenlétét; de még nem tűri azok közeledését. Az oestrus idején már ugrálja társait és hagyja, hogy a kanok ráugorjanak és befedezzék. Jellegzetes a péraduzzanat, és a véres ivarzási nyák ürülése, valamint, hogy a szuka a gáttájék érintésére- elsősorban az oestrusban- "csavargatja a farkát" és kontrakciókat lehet kiváltani a hüvely falának érintésekor. A hüvelytükrözéssel a hüvelynyálkahártya állapotát vizsgáljuk. Prooestrusban ez erősen duzzadt (oestrogen hatás), sima fényes, nedves felületű és véres váladékkal fedett. A ciklus előrehaladtával, oestrusban a duzzanat csökken (lecsengő oestrogen hatás), a váladék színe vizezett vér, majd barnás lesz, a felület erősen ráncolttá válik és tapadós, száraz jelleget ölt. A tüzelés elmúltával a metoestrus-anoestrus idején hosszanti sima ödéma-mentes enyhe ráncokat lehet felfedezni, kevés nyálkás, áttetsző váladékkal fedetten.

A hüvelykenet mikroszkópos vizsgálata

A ciklus során a nemi hormonok hatására jelentős változások mennek végbe a hüvelynyálkahártyán, melyek alkalmasak az ivarzás termékeny időszakának meghatározására. A tulajdonképpeni tüzelés első szakasza a prooestrus, mely a folliculogenezis időszakának felel meg, így az uralkodó hormon az ösztrogén (17- -ösztradiol), mely a genitáliákra gyakorolt hatása mellett az ivarzó állatra jellemző viselkedés kialakításáért is felelős. A prooestrus idején hüvelynyálkahártya sejtrétege a nyugalmi időszakra (metoestrus vége, dioestrus) jellemző 2-4 soros sejtrétegről, ösztrogén hatására 14-16 rétegűvé válik (proliferatio), illetve a felületi hámsejtek az elégtelen tápanyagellátás következtében fokozatosan elhalnak, elszarusodnak (cornificatio), és könnyen leválnak (desquamatio). A női nemi hormon hatására kialakuló bővérűség az endometriumban erythrocyta diapedesist okoz, így főleg a prooestrus elején jelentős mennyiségű vörösvértest keveredik az ivarzási váladékhoz. A legmagasabb ösztrogén koncentráció az LH csúcs előtti napokban jelentkezik, majd jelentősen csökken, a hámsejtek cornificatioja azonban tovább halad, és az LH csúcsot követő 3-6. napon éri el maximumát; így a citológiai vizsgálat alkalmassá válik a szuka fertilis időszakának meghatározására.

A mintavétel ideje:
A hüvelycitológiai vizsgálat sorozatvizsgálat, lényege a ciklus során a hüvelynyálkahártya hámrétegében végbemenő citológiai változások diagnosztizálása, ezért egy mintavételből általában a fertilis periódus meghatározása nem végezhető el, hanem a prooestrustól az oestrusig folyamatosan nyomon kell követni a ciklus alakulását. Az első mintavétel a prooestrus 4-5. napján javasolt (prooestrus kezdete: véres ivarzási váladék megjelenése), és 2-3 naponta ismételt mintavételek szükségesek a citológiai oestrus megjelenéséig (kornifikációs ráta 90%).

A mintavétel módja:
Gyakorlati körülmények között a hüvelycitológiai vizsgálatra a mintát a legegyszerűbben egy 12-14 cm hosszú érfogó hegyére csavart vattatampon segítségével gyűjthetjük. Az érfogót, a szuka hüvely anatómiáját követve, craniodorsalisan, majd craniálisan bevezetjük a hüvelybe, majd a citológiai mintát minél mélyebbről, a hüvely dorsalis faláról gyűjtjük, az eszköz nyálkahártyához való többszöri dörzsölésével, forgatásával. A kenet készítése során a tampont zsírtalanított tárgylemez felületére hengergetjük..

A minta vizsgálata
A nativ kenet mikroszkópos vizsgálata:
A kenetet fedőlemez nélkül, közvetlenül a mintavétel után, festetlenül is elbírálhatjuk, így azonban csak a sejtek alakjából ill. azok elrendezéséből következtethetünk a ciklus státuszára.

A kenetek festése
A mintavétel után ajánlatos a keneteket azonnal fixálni, majd az alább ismertetett festési eljárást elvégezni. A különböző oldatokat festőtégelyekbe töltve végezzük el a merítéses festési fázisokat.

Harris-Shorr -féle festés :
" Kenet fixálása: Merckofix spray (MERCK, Darmstadt)
" 70% alkohol: 10x belemerítés
" 50% alkohol: 10x belemerítés
" Mosás destillált vízzel. : 10x belemerítés
" Harris's hematoxylin-oldat ( MERCK, Darmstadt): 2 min
" Mosás destillált vízzel: 2x belemerítés
" Ammonia-alkohol : 1min (97 rész 70% alkohol + 3 rész 25 % ammónia -oldat)
" Mosás destillált vízzel: 1x belemerítés
" 70% alkohol:
" 95% alkohol: 1 x belemerítés
" Shorr-féle festék oldat (MERCK, Darmstadt): 2 min
" 95% alkohol: 1 x belemerítés
" Absolút alkohol (100%): 1 x belemerítés

A festett kenet mikroszkópos vizsgálata
A szuka ciklusa során az alábbi sejttípusok figyelhetők meg a hüvelykenetben, a nemi ciklus egyes szakaszainak megfelelő eltérő gyakorisággal. A sejtek festődésére vonatkozó jellemzők, a Harris-Shorr-festés alkalmazásakor figyelhetők meg.
Basalis sejtek:
Közvetlenül a basalis membránon helyeződnek ezért nagyon ritkán lelhetők fel a kenetekben. Apró, kerek szabályos elrendeződésű csoportokban előforduló sejtek, nagy kerek, sötétkékre festődő maggal.
Előfordulás: ritkán metoestrus végén, anoestrusban
Parabasalis sejtek:
A kenetekben gyakran megfigyelhető legkisebb (10-20 mikron) kerek, epitheliális sejtek. A hatalmas kerekded nucleus a sejtátmérő 45-90%-át is kiteheti, sőtétkékre festődik, míg a fennmaradó citoplazma szegély világosabb kék árnyalatot mutat (basofil festődés).
Előfordulás: korai prooestrus, illetve a metoestrus-anoestrus gyakori sejtalakja.
Kis intermedialis sejtek:
Átmenetet képeznek a nagy intermedialis illetve az elszarusodott laphámsejtek felé. A parabasalis sejteknél nagyobb (20-60 mikron), kerek vagy ovális alakú sejtek. A sejtmag nagy (30-35%-a a sejtátmérőnek) és vacuolizált, de kevésbé basofil (kék festődés), mint a parabasalis sejteknél. A citoplazmaszegély halványabb kékre festődik.
Előfordulás: prooestrus, metoestrus, anoestrus. A metoestrusban gyakran neutrofil granulocitákkal a citoplazmában előforduló kis intermedialis sejteket metoestrus sejteknek is nevezik.
Nagy intermedialis sejtek:
Ezek a sejtek inkább alakjukkal, sem mint nagyságukkal különböznek a kis intremediális sejtektől. Szögletessebb alakúak, de még aktiv nagy basofilan festődő magjuk van. Mivel ezek a sejtek képviselik azon utolsó sejtgenerációt a nyálkahártya felületén, melyek még elégséges tápanyagellátásban részesülnek, ezért késői, vagy felületes intermedialis sejteknek is nevezik őket. Nagy (40-75 mikron), lapos, szögletes, szabálytalan sejtek, gyakran felpöndörödött, ráncolt sejtszéllel. A sejtátmérő 15%-át kitevő nucleus narancssárga-lila (basofil-eosinofil átmenet), a citoplazma világosabb kék festődést mutat.
Előfordulás: prooestrus, oestrus, metoestrus eleje.
Elszarusodott laphámsejtek:
Szabálytalan, szögletes alakú, lapos sejtek, pyknotikus sejtmaggal, vagy mag nélkül. Sejtek széle gyakran felpöndörödő, ráncolt, pikkelyszerű képet mutat. A kenetben oestrus idején nagyszámban fordulnak elő, csoportokba, rögökbe tömörülve. Két formájukat különböztetjük meg a cornificatio mértékétől függően: részlegesen elszarusodott laphámsejtek ( narancssárga, eosinofil festődés a magban ill. maradványain és a cytoplasma nagy részén, de a sejtszél közelében enyhe kékes, basofil festődés); teljesen elszarusodott laphámsejtek ( eosinofil festődés az egész sejten).
Előfordulás: prooestrus-oestrus átmenet, oestrus, metoestrus legeleje.
Vörösvértestek:
Apró kerek, csoportokba rendeződő sejtek, narancsvörös festődéssel.
Előfordulás: prooestrus, oestrus eleje
Fehérvérsejtek:
Neutrophil granulocyták migráció révén kijutnak a hüvelynyálkahártya felületére. Oestrus utáni megjelenésük a metoestrus kezdetének legbiztosabb citológiai jele.
Előfordulás: korai prooestrus, metoestrus.
A prooestrus oestrus és metoestrus-anoestrus jellegzetes citológiai képeit a függelék tartalmazza.

Hormonális vizsgálatok
A pontos ovuláció diagnosztikai módszerek közül ma már nem hiányozhatnak a hormonális vizsgálatok. Az ovuláció időpontjára vonatkozó legpontosabb eredményt az LH-csúcs meghatározására alkalmas tesztek adják, azonban az igen rövid hormonális "pick" eltalálása gyakori vérvételt kíván (48 órán belül 6-8), ezért a módszer nem gyakorlatias. A klinikai praxis számára jól használható tesztek a vérszérum progeszteron-szintjének meghatározását végző ELISA-tesztek (TARGET, BVT, QUANTICHEK). Mivel a kutyában mérhetően magas preovulációs progeszteron termelés folyik, és szabályosan a változik a ciklus eseményeinek előre haladtával, így alkalmas az egyes élettani változások indirekt meghatározására. Működésük elvi alapja, hogy az antitesttel érzékenyített felületű ELISA-lemez mélyedéseibe jelölt P4-t (konjugátum) és a mintát cseppentjük, melyek között versengés indul meg a kötőhelyekért. Inkubáció után, a nem kötődött anyagot eltávolítjuk (mosás), majd az enzimmel jelzett, és megkötött P4 mennyiségét meghatározzuk. Ily módon, indirekt úton kiszámolható a minta P4 koncentrációja is. Ezek az eljárások viszonylag rövid idő alatt kb. 2 h), elég pontos eredményt adnak és jól használhatók a pontos ciklusdiagnosztikában.

1."versengés" a kötőhelyekért a minta és a konjugátum között
2. inkubáció után a nem kötődött anyag eltávolítása (mosás)
3. jelzett enzim mennyiségének meghat. (szubsztrát hozzáadása: tetra-metil-benzidin TMB+H2O2)
4. színreakció elbírálása

Az alábbi táblázat segít a kapott P4-szint értékek diagnosztikai jelentőségének értelmezésében.

1 táblázat
Termékenyítés optimális időpontja a vérszérum progeszteron-szintje alapján:

P4 érték Mesterséges termékenyítés/fedeztetés optimális időpontja
> 12ng/ml (7. nap) Azonnal (korai ovuláció)
<5 ng/ml További mintavételek
5-6 ng/ml 33-57 h belül
6-12 ng/ml Másnap
>12 ng/ml Azonnal

Ultrahang diagnosztika
Az utóbbi években egyre terjed a petefészek ultrahang diagnosztikai vizsgálata, elsősorban a tüzelés alatt, hiszen a prooestrusban a növekedő tüszők folyadékkal telt apró echoszegény képletként tünnek fel a petefészek felületén, majd az ovulációval " eltünnek", hiszen folyadéktartalmuk megszűnik. Gyakorlott vizsgáló 5-7,5 MHz vizsgálófejjel a vesetájékon a vese caudális csúcsától 1-2 cm-re fedezheti fel folliculusokat. Jelentőségük lehet az anovulációs ciklusok diagnosztizálásában.

A hüvelyellenállás mérés
A szukák hüvelyének ellenállása a váladék klorid-ion tartalma változásának hatására az ivarzás alatt, bizonyos szabály szerint alakul, és mérőműszer segítségével (DRAMINSZKY hüvelyellenállás mérő, PRIMAVET) alkalmas lehet a fertlitási optimum meghatározására. Az irodalmi adatok szerint a hüvely elektromos ellenállása a szukák tüzelése során a következő szabályszerű lefolyást mutatja: a prooestrous kezdetén igen alacsony (120-220 ohm) értékről indul, majd elér egy magasabb csúcsot (700-980 ohm), amelyen 2 napig stagnál, ez az úgynevezett "plató", majd hirtelen csökkenő értékek jelentkeznek. A vizsgálatok szerint az ovuláció megközelítően a mért legmagasabb értéknél következhet be és ezért a termékenyítés optimális idejét a jelentkező csökkenő ellenállási értékeknél javasolható.

A kutyasperma vizsgálata és tartós tárolásának lehetőségei

A kan kutya nemi reflexei

A kutya esetében is a hím nemi reflexek az alábbi sorrendben épülnek egymásra az erekció-ejakuláció reflexláncolatában.
1. Erekciós reflex
2. Felugrási és átölelési reflex
3. A hímvessző bevezetési reflex
4. Az utólökés és ejakuláció rerflexe
A környezet ingerei jelentős szerepet játszanak a reflexlánc beindításában, e hatások közül kutyánál elsősorban a szagingerek (olphactoricus) és a látás ingerei (visualis) játszanak szerepet.

3. ábra: Ejakuláció- Hím nemi reflexek

A központi idegrendszerbe érkező környezeti ingerek hatására létrejövő ingerületek, a nyúltvelőn, majd paraszimpatikus idegrostokon át, jutnak el a gerincvelő kereszttájéki szelvényébe, ahol az erekció központja található. Szintén paraszimpatikus rostokon át jut tovább az ingerület a pénisz erectilis részeihez (barlangos testek), majd az onnan visszatérő ingerületek (taktilis és thermoreceptív ingerek) ugyancsak paraszimpatikus idegeken keresztül jutnak vissza a keresztszelvénybe. Az egyre fokozódó ingerületi hatás a keresztszelvényi erekciós központban egy idő után átlépi az ingerküszöböt és visszahat a gerincvelő ágyéki szakaszában lévő ejaculatio központra, ahonnan már szimpatikus idegen át (plexus hypogastricus) vezetődik az ingerület az ondóvezetőbe és a járulékos nemi mirigyek simaizomszövetébe, kiváltva ezzel az ejaculatiot. A hím nemireflex-láncolat lefutását a 3.ábra foglalja össze. A kutya az ejaculatio típusát tekintve un. többfázisú asszinkron ejakuláló állat, ami azt jelenti, hogy hágómozgások után, a mellékhere és a járulékos mirigyek váladéka külön-külön fázisban ürül a lemagzás során.

Spermavétel kutyától

A spermatológiai vizsgálatok első lépése a spermavétel, mely kutya esetében mindig un. frakcionált típusú legyen. Ezalatt azt értjük, hogy külön-külön kell gyűjteni az első ( prosztata váladék) a második( sperma-gazdag frakció) és a harmadik frakciót (prosztata váladék). Különösen nagy jelentőségű a frakcionált spermavétel abban az esetben, ha a sperma tartós tárolása a cél, hiszen a prosztata váladék fokozza a sejtek anyagcseréjét és ez a spermiumok gyorsabb pusztulásához vezet. A spermavétel mindig nyugodt csendes környezetben lehetőleg tüzelő szuka jelenlétében történjen. A beavatkozás történhet manuálisan, műhüvellyel és esetleg elektroejaculátorral. A kutya esetében az un. manuális stimuláció a legelterjedtebb módszer a gyakorlatban, mely a pénisz tövénél lévő két duzzadó test (bulbus penis) mögötti terület ujjal történő ritmusos nyomogatását jelenti. Fontos, hogy még az erekció előtt lehetőleg buktassuk ki a péniszt és a két bulbust a fitymából, különben az erekció fájdalmat okozhat az állatnak. A mellékhere-frakció ürülését általában az un. átlépési-reflex jelentkezése után várjuk, de ettől jelentős eltérések lehetnek. Gyakran kimarad az első frakció és rögtön a sperma ürül, vagy különösen "flegmatikus" kanok esetében semmilyen átlépési reakció nem mutatkozik. A kutyasperma különösen érzékeny a hirtelen hőmérsékleti változásokra ezért a mintavétel mindig előmelegített (35-37 C ) spermavételi pohárba történjen, hogy kivédjük a hideg-sokkból adódó sejtpusztulást ill. sejtkárosodást. A kevésbé trenírozott kanok esetében előfordul, hogy az ejakuláció nem teljes, és a középső spermagazdag frakció kimarad. Az említett eset és az aspermia fennállásának differenciál diagnózisát segítheti az ejakulátum alkalikus-foszfatáz tartalmának meghatározása, mely csak a mellékhere frakcióban található, és így egyértelmű lehet a diagnózis.

2. táblázat: A kutyasperma normál paraméterei
pH: 6,3-6,7
Térfogat 1-30 ml
I. frakció 1-12 ml
II. frakció 1-2 ml
III. frakció < 20ml
Progresszív motilitás > 70%
Normál spermium morfológia > 80%
Abnormális spermium morf. <20 %
Totál spermium szám 400x106
Fehérvérsejt szám < 2000/ml
ALKP 5000-4000 NE/l
.
A legegyszerűbb és általában a legelső vizsgálati lépés a spermiumok mozgásának vizsgálata, mely melegíthető tárgyasztalú fénymikroszkóppal általában 200-300x nagyításon elvégezhető. Fontos a standard vizsgálati mennyiség (javasolható 10-15ul pipettával kimérve) alkalmazása minden vizsgálatkor, hiszen a túl vastag csepp megtévesztően jobb minőséget kölcsönözhet, illetve lehetetlen az amúgy is szubjektív mikroszkópos vizsgálat eredményeit reprodukálhatóvá tenni. Sokkal több információt nyújt a fáziskontraszt objektív használata, hiszen könnyebben megítélhető a mozgás sebessége, minősége, és a normális motilitású sejtek aránya. A normál mozgású spermium lineáris, gyorsan mozgó és kis amplitúdójú fejkilengéseket végez, gyorsan átcikázva a látótéren. A kóros mozgások a következők: oszcilláló-mozgás ( egy helyben mozgás) , manage-mozgás ( körben cirkuláló mozgás), hyperaktiv mozgás ( nagy fejkilengéssel, amplitúdóval jellemző cikázó, de viszonylag progressziv mozgás; általában acrosoma reagált sejtek). A spermiumok mozgásformáit befolyásolja a seminalis plazma pH-ja, összetétele, a mintavétel hőmérséklete vagy az esetleges spermahígító fajtája is. A motilitás vizsgálata mindig 4-5 különböző látótér átvizsgálásával történjen. Sokkal pontosabb és objektív adatot szolgáltatnak az un. számítógéppel vezérelt motilitás analizátorok (Computer Aided Sperm Analyser), melyek az igen vékony rétegben lévő spermamintában (10um) lévő sejtekről készített videofelvétel értékelése révén megadják a progresszív mozgó sejtek arányát a nem-progresszív mozgó sejtek arányát, a sejtek átlagsebességét és a minta sejtszámát is. Általában a softwear különböző színekkel jelöli az egyes mozgásformákba sorolható sejteket.
A rutin spermavizsgálat része kutya esetében is a spermiumok morfológiai vizsgálata, mely festetlen és festett kenetben végezhető el. A natív, fixált sperma morfológiai vizsgálata (Formol-saline fixáló, 3. táblázat) elsősorban a fej az acrosoma és a középrész elváltozásainak diagnosztizálására alkalmas módszer. A vizsgálat során 2ml fixáló-oldathoz 2 csepp natív, hígítatlan spermát adunk, majd az elegyből 5ul mennyiséget tárgylemezen, fedőlemezzel lefedve 1000x nagyításon 100 sejtet immerzióval vizsgálunk. A módszer hátránya, hogy csak natív spermánál alkalmazható, hiszen a tojássárga tartalmú hígítók koagulálódnak, előnye viszont, hogy igen egyszerű, gyors módszer, és a minták korlátlan ideig archiválhatóak.

3. táblázat.
Formalinos-spermafixáló:
-Na2HPO4 x 2H2O 6,19g
-KH2PO4 2,54g
-Formalin cc. 125 ml
-NaCl 5,41g
Dest víz ad 1000 ml

A festett kenetek mikroszkópos vizsgálata során, általában 1000x immerziós nagyítással legalább 200 sejtet kell elbírálni. A kenetkészítés szabályai megegyeznek a vérkenetnél megismertekkel. Számos festési eljárás közül a legismertebb az eosin-nigrosin festés (élő sejtek nem festődnek, halott sejtek rózsaszínűek), vagy a kongóvörös-kristályibolya festés, amely a rutin morfológiai vizsgálatokra alkalmas (4. kép). A spermiumok acrosoma sérüléseinek vizsgálatára alkalmas az un. Spermac vagy Diff Quick-festés, mely festék-kittek kereskedelmi forgalomba kaphatóak.
Kórtani szempontból megkülönböztetünk primer és szekunder, vagy major és minor spermium morfológiai defektusokat (primer: a herében, a spermatogenezis során kialakult, szekunder: a here elhagyása után, a mellékherében vagy az ejakuláció, spermavétel során kialakult elváltozások).

4. kép.: Kongóvörös- kristályibolya festés. Spermium morfológiai rendellenességek:
egyszerűen hajlott farok ( ), feltekeredett farok ( ) szögbetört farok ( ).

A morfológiai deformitásoknak igen komoly diagnosztikai jelentőségük lehet:
" prosztatagyulladás, heregyulladás (farokdefektus, idegen sejtek; fehérvérsejt, vörösvértest)
" Brucellózis (protoplazmacsepp, acrosomális defectus, középrész elvált., "fej a fejhez " agglutináció, azoospermia)
" -szexuális absztinencia( acrosoma def., magányos fej)
" -szexuális kihasználtság (proximalis plazmacsepp)
Különösen gyakori a farok rendellenesség (egyszerűen hajlott farok, cytoplasma-cseppel) jelentkezése hypothyreoid kanoknál, hiszen a csökkent tesztoszteron termelés zavart okoz a mellékhere spermium maturációs folyamatában. Fertilitási szempontból a 20%-nál nagyobb arányban előforduló spermium morfológiai defektus már jelentős lehet, és fogamzási zavarokat okozhat. Az azonban bizonyos, hogy az ejakulátum magas sejtkoncentrációja kompenzálhatja a nagy százalékban előforduló abnormális sejtek fertilitás csökkentő hatását, és így gyakran a gyenge spermaminőséget produkáló kan nem mutatkozik infertilisnek a természetes fedeztetés során, viszont tartós tárolásra nem alkalmas a spermája.

A kutyasperma tartós tárolásának lehetőségei, spermahígítók

A kutyasperma tartós tárolásának a kutyatenyésztés fejlődésével egyre nagyobb jelentősége van, hiszen ez megkönnyíti az országok közötti szaporítóanyag szállítást, és a mélyhűtés megvalósításával a genetikai állomány hosszú távú megőrzésének is megteremtődnek a lehetőségei. A kutyasperma viszonylag érzékeny a környezet hőmérsékleti hatásaira, kezelése során óvni kell a "hideg-shock-tól", és fontos a frakcionált sperma vétel alkalmazása, hogy az eltarthatóságot csökkentő prosztataváladék ne kerüljön a spermába. A levétel után a kezeletlen, natív sperma kb. 12 h-ig életképes, de rohamosan csökken a motilis spermiumok aránya. A sperma hígítók alkalmazásával a sejtek életfunkciói hosszabb-rövidebb távon megőrízhetőek.. A hígítók izotoniás, izoozmotikus, jó pufferkapacitású, tápláló és védő anyagokat tartalmaznak, és azonos hőmérsékleten a spermához adagolva csökkentik a sejtek energiafelhasználását és lelassítják ill. kiegyensúlyozzák a spermiumok anyagcsere folyamatait, ezáltal meghosszabbítják a sejtek élettartamát.
A sperma konzerválásnak két formáját alkalmazzuk kutyasperma esetében a folyékony-hűtött (5-7C) és a mélyhűtött (-196C folyékony nitrogén,) formában való tárolást.
A hűtve tárolásra kifejlesztett hígítók általában un. TRIS-bázisú, tojássárga tartalmú hígítók, de használatosak fölözött tej alapú hígítók is. Néhány hígító összetételét a 5. Táblázat mutatja be.

5. Táblázat: Norvég kutyasperma hígító összetétele (Farstad and Andersen Berg, 1989)Összetevők Egység
TRIS 6,056 g
Citromsav 3,400 g
Fructose 2,500 g
Penicillin 200 000 NE
Dihydrostreptomycin 0,2 g
Tojássárgája 20%
Bidest víz 184 ml

6. táblázat.: A holland kutyasperma hígító receptje.
Összetevők Egység
TRIS 24,32 g
Glycocol 9,39 g
Cirtric acid 3,54 g
Glucose 7,50 g
Fructose 7,50 g
NaCl 1,00 g
NaHCO3 1,5 g
Tojássárgája 375 ml
Penicilline 200 000 NE
Streptomycine 2 g
Ad 1500ml bidest vízhez

A hígított, hűtött kutyasperma 4-7C között 48-72h át tárolható, a sejtek jelentősebb károsodása nélkül. Ennek a módszernek az előnye, hogy egyszerűen kivitelezhető, hagyományos un. intravaginális termékenyítési (ld. Később) technikával inszeminálható a sperma, nem igényel különösen pontos ovuláció diagnosztikát az eredményes felhasználása, és a vemhesülés aránya megközelíti a 75-80%-ot. Hátránya viszont a rövid felhasználhatósági idő.

A kutyasperma mélyhűtése

A kutyasperma mélyhűtés a 1960-as évek végén, 70-es évek elején kezdődött, kísérleti körülmények között, elsősorban más állatfajok spermamélyhűtési technológiájának adoptálásával. Bár napjainkra a mélyhűtési protokoll és a használatos spermahígítók összetétele számos változtatáson esett át - figyelembe véve a kutyasperma faji sajátságait- a sperma felolvasztás utáni minősége (élettartam, motilitás, morfológia) és fertilitása (50-60%) elmarad más a állatfajoknál elért eredményektől, de méginkább a friss spermával történő termékenyítések eredményeitől (75-80%). A korábbi vizsgálatokból (Oettlé 1986, Rodriguez-Martinez et al. 1993) valószínűsíthetővé vált, hogy a gyengébb mélyhűthetőség hátterében az ondósejtek extrém "hideg-shock érzékenysége" áll, mely különösen az acrosoma sérüléseiben jelentkezik; valamint számottevő egyedi különbözőség tapasztalható az egyes donorok spermájának mélyhűtési toleranciájában is. A sejtek jelentős része (kb. 60%) acrosoma károsultnak bizonyul a felolvasztás után, és bár ezek a spermiumok motilisak, mégis a károsodott acrosoma miatt nem képesek a petesejt megtermékenyítésére (5 kép).

5. kép.: Mélyhűtés utáni acrosoma károsodás és az acrosoma leválása kutyaspermium esetében (FITC-PNA fluorescein festés). A festődés a membrán sérülését, ill. permeábilitásának fokozódását jelzi.

Az acrosoma és az egyéb membránsérülések, valamint a sejtek energiai tartalékának kimerülése miatt, a felolvasztás utáni a kutyasperma élettartama igen rövid (kb. 12 h), ezért intrauterin termékenyítési technikát (ld. Később) és igen pontos ivarzás diagnosztikai munkát igényel az eredményes felhasználásuk. A vemhesülési arány még így is nagyon alacsony kb. 50-60%, valamint az átlag alomszám is 3-4 kölyök között van.
A kutyasperma mélyhűtés technikai részleteiről röviden az alábbiakat szeretném kihangsúlyozni, különös tekintettel az egyéb állatfajnál alkalmazott módszerektől való eltérésekre. A kutyasperma esetében fokozottabban igaz az a megállapítás, hogy csak kiváló minőségű ejakulátumot (morfológiai defectus < 15% és motilitás > 80%) érdemes mélyhűteni, hiszen a kutyaspermium rosszul tolerálja a hűtési-felolvasztási procedúrát, és általában 40%-a a sejteknek elpusztul. A spermahígításra a TRIS-tojássárga alapú spermahígítók terjedtek el a gyakorlatban, de léteznek kereskedelmi forgalomban kapható hígítók is (USA, KANADA) kifejezetten kutyasperma mélyhűtésére. Használhatók azonban a bikasperma mélyhűtésre alkalmazott hígítók egy része is ( Tryladil, Biociphos), amennyiben 7% körüli glicerint tartalmaznak. A mélyhűtés jellegétől függően (statikus vagy dinamikus) 6 ill. 8% glicerint kell alkalmazni a spermahígítóban. Lényeges és ajánlott lehet a sperma és az esetleges prosztataváladék elválasztása egy un. centrifugálásos mosással, mely során, a levételt követően, az 1:1 arányban meghígított spermát 1000rpm fordulatszámon 5 percig centrifugáljuk, majd a felülúszót gyorsan leszívjuk. A centrifugátumot (spermiumok) pedig óvatosan újra hígítjuk a megfelelő sejtszámra. A hígítási arány 100-150x106 sejt/ ml- re, vagy 1:4-hez. Az ajánlott equilibrációs idő 90 perc 4-7C-on, majd általában a spermát 0,5ml-es műszalmákba töltik. Egyes technológiák és mélyhűtési protokollok előnyben részesítik 0,25ml-es műszalmák használatát, de talán az előbbinek egyszerűbb a gyakorlati felhasználása. A mélyhűtés történhet programozható berendezés segítségével (dinamikus), amikor egy meghatározott hűtési protokoll szerint a számítógép vezérelte készülék folyékony nitrogén gőz segítségével végül 180C-ra hűti le a spermát, illetve lehetséges a műszalmák kb 70C-os nitrogén gőzbe helyezésével (Hungarocell dobozban folyékony nitrogén szintje fölött), amit un statikus hűtési folyamatnak nevezünk. Az utóbbi jelentősen egyszerűbb és nem igényel nagy beruházást, de nehezebben reprodukálható a jó mélyhűtési eredmény. Az egyes hűtési protokollokhoz idomulnak a felolvasztási technológiák is. A norvég módszer pl. a spermát 70C-os vízfürdőben 8 sec. alatt, míg egy másik 38C-on 1-2 percig olvasztja fel. Ezek a lényeges módszertani különbségek is azt tükrözik, hogy ebben az állatfajban még nagyon sok nyitott kérdés van a spermakonzerválás terén.

A mesterséges termékenyítés gyakorlati végrehajtása

A kutyatenyésztésben jelentősen más igények és okok vezettek a mesterséges termékenyítés bevezetéséhez, mint a gazdasági haszonállatok esetében, ugyan megjegyzendő, hogy sajnálatosan a "haszonállat" jelző manapság egyre inkább használható a kutya vonatkozásában is. A kutyatenyésztés fejlődésével és az erősen küllemre történő szelektálással ("show-kutyák") arányosan növekedett a beltenyésztettség foka és a szaporodásbiológiai mutatók romlása a fajtatiszta tenyészetekben. Növekedett a gyenge libidójú, tapasztalatlan kanok és az alacsony receptivitású, vagy csendesen tüzelő szukák száma is. A kontinensek közötti spermatranszport fejlődését, előmozdította az a tény, hogy a csúcs tenyészkanok "elérhetővé" váltak komoly utazások megtétele nélkül. A fedeztetések és a termékenyítések arányáról nehéz pontos statisztikai adatokat közölni, hiszen az egyes országok tenyésztői klubjai különböző regisztrációs szabályokat fogalmaztak meg a mesterséges termékenyítés alkalmazásával kapcsolatosan. Az viszont tény, hogy a legelterjedtebb USA, Kanada és Skandinávia esetében, ahol igen komoly bejelentési kötelezettséggel is bírnak ezek a beavatkozások a klubok felé. Amerikában sok tenyésztő önállóan végzi, míg Európában jobban az állatorvosok kezében van még ez a beavatkozás. Hazánkban semmilyen szabályozás alá nem esik a kutya mesterséges termékenyítése, viszonylag terjedőben van a beavatkozás, de igen sok tenyésztő saját maga alkalmazza, különösebb szakirányú előképzettség és kontrol nélkül. A beavatkozás eredményességét így nem lehet megítélni, hiszen egyrészt nem szakemberek is végzik, másrészt jórészt a problémás esetekben alkalmazzák., szemben az Észak-Amerikai gyakorlattal, ahol elsősorban a venereális fertőzések megelőzése és a sperma transzport elterjedése áll a háttérben.
A kutya mesterséges termékenyítésénél különösen igaz az a kitétel, hogy a siker kulcsa a pontos ovuláció diagnosztikában, a kiváló minőségű sperma felhasználásában és a megfelelő inszeminálási technika alkalmazásában rejlik. Az alkalmazott termékenyítési technika függ a sperma kiszerelésétől, értendő ezalatt, hogy más inszeminálási módszert igényel a friss, illetve hígított és a mélyhűtött kutyasperma.

Intravaginális termékenyítés

A friss vagy hűtött ondó esetében elegendő a spermiumokat a hüvely mélyére, a méhszáj közelébe (intravaginális termékenyítés) deponálni egy katéter segítségével, majd a szuka hátsó testfelét kb. 15 percig 45 -os szögben megemelve kell tartani, ezzel helyettesítve a természetes fedezéskor kialakuló "összeragadás" jelenségét. A beavatkozás során a gyakorlatban általában az egész ejakulátum inszeminálásra kerül, de hígított-hűtött spermánál is a sejtszám 200M/ml sejt felett van. Lényeges a testhőmérsékletű eszközök és ondó használata, valamint a termékenyített sperma mennyisége lehetőleg ne haladja meg a 10ml-t, különben jelentős visszafolyás jelentkezik. A fogamzási arány 70-80% körüli, amely megközelíti a természetes fedeztetés eredményességét.

Intrauterinális termékenyítés

Ez a termékenyítési technika a mélyhűtött sperma eredményesebb felhasználásához szükséges, hiszen a sejtek rövidebb ideig életképesek (kb. 12h), csökkent az energiakészletük és a motilitásuk, ezért minél közelebb kell őket a megtermékenyítés helyszínéhez juttatni. Továbbá a spermiumok számára az uterus sokkal kedvezőbb környezet, mint a vagina végső szakasza. Szukánál a termékenyítő anyag méhbe juttatásának azonban anatómiai nehézségei vannak; igen hosszú a vagina (15-20cm) a végén kb. 3-5 cm szűkülettel (dorsalis redő) és a méhszáj cranio-dorsalisan, kúpszerűen nyílik a hüvelybe. Jelentősen megnehezül ezért a hüvelyen keresztüli cervixbe ill. méhbe termékenyítés kivitelezése. Speciális un. Skandináv katéter ( 5. Kép.) segítségével kis és közepes méretű, normál kondíciójú szukán, hosszú gyakorlattal lehetséges az intrauterin termékenyítést elvégezni, úgy, hogy az egyik kézzel rögzítjük a cervixet a hasfalon keresztül, míg a másikkal bevezetjük a katétert.

5. kép.: Kutya inszemináló katéterek. Fent az un. Skandináv katéterek különböző méretben, legalul, fecskendővel ellátva a hagyományos, intravaginalis termékenyítésre alkalmas katéter.

A katéter megfelelő helyeződését a méhszáj körbetapintásával ellenőrizzük, nehogy az egyik oldalsó vaginális vakzsákba történjen a termékenyítés. Ha megfelelő helyen van az eszköz, akkor a sperma könnyen injektálható. Jóval költségesebb, de szintén a nem-sebészi eljárások közé tartozik az endoszkópos vagino-cervicalis termékenyítés. Ilyenkor egy munkacsatornás endoszkópot használva vizuális kontrol mellett vezetjük a termékenyítő katétert a hüvelyen át cervixbe, és végezzük el a termékenyítést.
A sebészi inszeminálási eljárások alkalmazása kutyáknál Európában állatvédelmi okok miatt kiszorulóban vannak, de hatékonyságuk elég jó főleg a gyengébb minőségű sperma felhasználása esetén. A normál laparotomia során a méhet felkeresve kiemeljük a cervixet a hasfalsebbe, és a méhfalon át a méhtest lumenébe vezetett vénakatéter segítségével juttatjuk a spermát a méhbe (6. Kép)

6. kép: Sebészi intrauterin termékenyítés mélyhűtött kutyaspermával.

A mélyhűtött sperma sikeres felhasználásának alapvető feltétele a nagyon pontos ovuláció diagnosztika, mely nem nélkülözheti az alapos hüvelycitológiai vizsgálatot és a pontos progeszteron-szint mérést. A termékenyítés optimális időpontját a P4-szint alapján határozzuk meg, mely oestrusban, a 10-12 ng/ml közötti tartományban javasolt. Sebészi esetén egyszeri míg a nem-sebészi módszerek alkalmazásakor 24 órás különbséggel két termékenyítés javasolt. A fogamzási arány nagyban függ az alkalmazott technológiától és a termékenyítést végző személy felkészültségétől. A sebészi módszer esetében általában 50-60% közötti, míg a nem-sebészi termékenyítések során a Skandináv országokban 70-75%-os vemhesülésről számolnak be. Hazánkban az alacsony esetszám és a regisztráció hiánya miatt nem lehet pontos adatokkal szolgálni. A szerző saját praxisában kizárólag sebészi termékenyítést alkalmazva 55%-os fogamzási eredménnyel végzi a beavatkozást. Az alomszámok kevésbé kiegyenlítettek ( átlag 3,2 saját eredmények)a mélyhűtött sperma alkalmazása során, melynek hátterében az ovuláció diagnosztika tökéletlensége és a felhasznált sperma gyengébb minősége állhat. Jelentős tényező azonban, hogy csak olyan szukákat szabad bevenni a programba, melyek kifogástalan szaporodásbiológiai előélettel rendelkeznek és már legalább egyszer ellettek.

A kutya vemhességének megállapítása

A megtermékenyüléstől a vemhesség kialakulásáig

A kutya vemhessége gyakorlatias számítással 58-62 nap. A pontos számadat csak akkor mondható ki, ha a hosszú ivarzási ciklus egy jól meghatározható időpontjától számítjuk a vemhességet, ezért szakmai körökben a petesejt leválását kiváltó hormonhatástól (LH-csúcs) szokás számolnia vemhesség hosszát.
A szuka petesejtjei leválásukat (ovuláció) követően a petevezetőben még átesnek egy utóérésen (36-48 óra) majd fertilissé válnak és az érett petesejtek kb. 2-3 napig alkalmas a megtermékenyülésre. Ha megtörténik a megtermékenyítés az osztódásnak induló megtermékenyített petesejtek (zygóták) kb. 9-12 napig maradnak a petevezetőben, majd leérnek a méhbe, ahol vemhesség 18. napjáig vándorolnak, igyekeznek egyenletesen elhelyezkedni a méhben, majd a 20-21. nap körül beágyazódnak és kialakulnak a méhlepények. Ez a szakasz az orvos számára egy nehezen vizsgálható része a vemhességnek, nem tudjuk biztosan megállapítani, vajon tényleg vemhesült-e a szuka, a magzat ultrahang-vizsgálattal még nem fedezhető fel és nincs megbízható hormonális vizsgáló módszer sem. A progeszteron- szintnek ilyenkor normálisan igen magasnak kell lennie (20-60ng/ml), de ez nem jelenti azt, hogy biztosan vemhes a szuka, hiszen a vemhes és a nem-vemhes szukában gyakorlatilag ugyanazok a hormonális változások játszódnak le. Ugyanakkor a progeszteron- szintnek az élettani szint alá csökkenése nem jó jel, és az állat kezelésre szorul a vehem megtartása érdekében. Az embrió beágyazódásáig, illetve kutyánál kb. a 25-30. napig képesek a magzatok szinte nyomtalanul felszívódni, ezért van a korai vemhesség diagnosztikának óriási jelentősége (24. naptól) hiszen így elkülöníthetőek a meddőségi problémák a korai embrióelhalástól, és ennek a későbbiekben terápiás jelentősége lehet. Gyakorlott szakember a vemhességet kutyában ultrahang-vizsgálattal a 24. naptól nagy biztonsággal diagnosztizálni tudja (1-2. kép). Gyakran felmerülő igény, hogy a pontos születendő alomszámot állapítsuk meg. Ez nem könnyű feladat, több éves gyakorlat és kiváló készülék birtokában is csak plusz-mínusz 1 magzat pontossággal lehet behatárolni a magzatszámot a kutya hosszú méhszarvai miatt. Az a tény viszont nagy biztonsággal megállapítható, hogy esetleg csak 1-2 magzat van, aminek nagy jelentősége lehet, hiszen ezek túl nagyra nőhetnek és abszolút nagy méretük miatt nehézellést okozhatnak. Egy magzat esetében pedig számolni kell azzal, hogy időben nem váltja ki az ellést megindító "magzati" szignált és túlhordás alakul ki (65. napon túli vemhesség), amely gyakran a magzat méhen belüli elpusztulásához vezet.